特应性皮炎（AD）在皮肤状况中始终是一个重大威胁，导致患者残疾，其患病率持续上升（1，2）。AD的一个标志是表皮屏障受损，主要源于异常的脂质代谢，导致神经酰胺和脂肪酸（FA）谱紊乱角质层（3-5）。AD管理的黄金标准包括日常局部润肤剂的应用与反应性或主动性局部使用相结合
糖皮质激素（GC）或钙调神经磷酸酶抑制剂（6）。地塞米松（DEX）是一种广泛使用的糖皮质激素治疗炎症性皮肤功能障碍，如特应性皮炎。即使被认为是一种低效力的糖皮质激素（7），有一些不良反应与其局部应用及其经皮渗透的局限性相关。
纳米技术可以为开发创新载体提供不同的工具，例如用于药物递送的脂质纳米粒子。固体脂质纳米粒子（SLN）提供生物矢量化和提高生物利用度、生物相容性和生物降解性（3，8）。从这个意义上讲，这些封装系统可以促进药物的渗透，以及对这些化合物的保护物理化学变化或降解（8）。这些特性可用于局部配方，提供优化的皮肤释放，以及改善从而减少不良反应的发生。
角质层（SC）是最外层的表皮层，提供有效的屏障用于许多外源性物质，包括局部制剂。SC由角质细胞形成，主要由角蛋白组成，浸泡在不可渗透的脂质基质中疾病与这种脂质介质的改变有关，导致皮肤屏障并导致作为炎症过程的临床表现，包括特应性皮炎和银屑病（3、4）。除了SC神经酰胺和胆固醇、游离脂肪酸（FA）在皮肤屏障功能和水损失的调节。由FA组成的脂质纳米颗粒的开发。因此，类似于表皮中存在的那些可能是局部递送的良好策略，因为它们可以将优化的递送与润肤剂保护作用相结合。
可持续技术方法是研发和创新领域以及当前欧洲的热门话题联盟和联合国的发展政策。此外，在欧洲将提高其复原力，并探索当地来源的生物材料作为创新配方的基础。可以查看黑水鞥呢幼虫的生物量作为具有高聚集价值和营销潜力的化合物的来源可持续的有机物生物转化过程用作其基质，发展已知黑兵蝇（BSF）的幼虫生物量富含蛋白质、维生素、矿物质，最重要的是脂质（9）。BSF幼虫的脂质含量为主要由饱和FA组成，即月桂酸（C12:0），其次是棕榈酸（C16:0）、亚油酸（C18:2）和油酸（C18:1n-9）（10）。这种BSF幼虫的FA混合物生物质作为一种新的可持续成分具有巨大的潜力，可以应用在基于皮肤纳米技术的配方中作为润肤剂原料（9）。
在这项研究中，使用可持续、天然和多功能的原材料，尝试了DEX皮肤纳米递送的创新策略。基于BSF脂质提取物的SLN被设计用于治疗特应性皮炎，最终提供控释和润肤剂特性。通过Box-Behnken设计（BBD）方法开发了优化的DEX负载SLN，并在储存稳定性和体外药物释放方面进行了进一步的物理化学表征。SLN对HaCaT细胞的影响通过MTT测试评估生存能力，并进行内化测定以评估纳米颗粒渗透这些细胞的能力。总的来说，这项概念验证研究旨在将昆虫幼虫油确立为一种可持续的多功能成分，以生产负载糖皮质激素的纳米制剂来应对AD。
BSF幼虫由Entogreen®公司提供。脂质提取物是通过使用有机溶剂的浸渍技术从其生物质中获得，如由Almeida等人（10）描述。DEX得自AppliChem GmbH（Darmstadt，德国）和来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）的Tween®80。
2.2 SLN准备
SLN是通过热均化和使用Q125超声处理制备的Sonicator（美国康涅狄格州纽敦的QSonica Sonicators）。简单地说，将脂质提取物混合使用Tween®80（脂质相），并在50°C的水浴中融化。蒸馏水是加热至与脂质相相同的温度。在融化脂质提取物后将加热的蒸馏水加入到脂质相中，然后进行超声处理（70%振幅5分钟）。然后将得到的制剂在室温下冷却。
幼虫脂质提取物（5%）制备SLN的初步筛选w/v）使用不同量的表面活性剂（60mg或80mg）进行。对于DEX负载的SLN的制备，药物在BSF中的最大溶解度测定脂质提取物。在SLN制备过程中，药物溶解在维持脂质相和程序的所有其他步骤。
2.3 SLN物理化学表征
SLN的粒径（PS）、多分散指数（PDI）和ζ电位（ZP）使用NanoBrook Omni设备（Brookhaven Instruments，Holtsville，NY，USA）。PS和PDI测量由动态光散射（DLS），由60秒的三个读取周期组成。ZP分析为通过相位分析光散射考虑一次30个读取周期执行（朋友们）。为了进行分析，将等分的制剂在蒸馏水中稀释（50倍）。测量在25°C下进行，一式三份。
在采用超滤离心技术后，通过测量DEX的未负载部分来估计SLN的包封效率（EE）和负载容量（LC）。首先，用蒸馏水以1:1（v/v）稀释DEX负载的SLN，并将其转移到VIVASPIN®500离心装置（50 KDa，Sartorius，Goettingen，德国）。然后将样品以12000×g离心（Hermle Z323K离心机，Hermle LaborTechnik，Wehingen，Germany）60分钟。之后，将穿过滤膜的上清液在水：乙醇溶液（75:25）中稀释。通过记录DEX来确定DEX的未加载部分紫外线/可见光分光光度计（Evolution®300，Thermo Scientific，Hertfordshire，UK）中241 nm处的吸光度，考虑到在相同溶剂混合物中获得的DEX校准曲线。最终根据方程1和2计算EE和LC。
其中[DEXT]是制剂中DEX的总浓度，[DEXUL]是滤液中定量的未负载DEX的浓度，而EXLT]是用于配制纳米颗粒的脂质提取物的总浓度。
2.4 Box-Behnken设计的SLN优化
SLN制剂的优化基于实验设计（DOE）策略，通过应用15次运行、3因素、3级Box-Behnken设计，旨在实现自变量的最佳组合，以生产用于局部给药的优化制剂。
选择表面活性剂、脂质提取物和DEX的量作为因素（自变量），选择PS、PDI、ZP、EE和LC作为反应（因变量）。根据初步研究的结果，每个因素确定了三个水平进行测试（表1）。对于每个响应要获得的期望值也在表1中给出。在使用Statistica®软件（Statsoft，Tulsa，OK，USA）对15种SLN配方获得的数据进行数学分析后，预测了每个因素达到更高期望水平的最佳水平。通过制备一式三份的of并将实验获得的物理化学性质（PS、PDI、ZP、EE和LC）与统计分析预测的理论性质进行比较，验证了优化的SLN制剂（of）的组成。
表1。为Box-Behnken设计（BBD）选择的自变量和相应水平。还提出了因变量和所选的合意性标准。
2.5 SLN储存稳定性
根据ICH指南（11），通过将制剂在25±3°C下保持60天，并在制备日后的特定时间点（7、14、30、45和60天）根据PS、PDI、ZP、EE、LC和pH对其进行表征，来评估优化的SLN的储存稳定性。所有测量一式三份，并根据第2.3节中描述的规范进行。在室温下用标准溶液校准后，使用744 pH计（Metrohm AG，Herisau，Switzerland）获得pH值。
2.6体外药物释放
基于透析袋扩散法对来自优化的SLN的DEX进行体外释放研究。透析膜（Spectra/Por™1，MWCO 6-8 KD，Spectrum™，Rancho Dominguez，CA，USA）在蒸馏水中预水合约30分钟。受体室包含80 ml磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）和乙醇（75:25）的混合物，保持在37±2°C，并用磁力搅拌，搅拌棒在整个实验过程中。将优化的SLN制剂（1.75ml）一式三份引入透析膜中，并置于受体培养基中。以预定的时间间隔，从受体室中取出等分试样（2ml），并用等体积的新鲜受体溶液代替，以确保沉降条件。对提取的样品进行适当稀释，并使用紫外/可见分光光度计（Evolution®300，Thermo Scientific，Hertfordshire，UK）在241 nm处使用校准曲线法进行累积药物释放分析。
2.7细胞培养和体外细胞毒性
使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）细胞活力测定法评估DEX、脂质提取物、空载SLNs和负载DEX的SLNs的细胞毒性。以人角质形成细胞HaCaT细胞系为模型。将细胞维持在37°C、5%CO2气氛中，并在补充有10%胎牛血清（Enzyfarma）的DMEM低葡萄糖培养基（Biowest）中培养和2%青霉素-链霉素（Enzyfarma）。对于活力测试，将细胞以1x104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并生长24小时。添加不同浓度（相当于0.01-100µM DEX）的待测试的每种化合物或制剂，并静置孵育24小时。DMSO（终浓度5%）使用水或水∶DMSO溶液作为载体对照。将细胞与MTT（0.5mg/mL）孵育2小时，用PBS洗涤并用DMSO溶解所得到的甲zan。在微孔板读取器（Synergy HTX，BioTek Instruments，Bad Friedrichshall，Germany）中在595nm处测量吸光度，并且与载体对照孵育的细胞被认为是100%存活的。
2.8内化测定
通过将荧光探针（1mg）溶解在脂质相中制备负载异硫氰酸荧光素（FITC）的SLN，并且SLN生产程序的所有其他步骤保持不变。制备后，将负载FITC的SLN在PBS中进行透析（Spectra/Por™1，MWCO 6-8 KD，Spectrum™，Rancho Dominguez，CA，USA）24小时，以去除未包封的FITC部分。为了评估SLN渗透HaCaT细胞的能力，进行了细胞摄取测定。将细胞以3x105个细胞/孔的密度接种在12孔板中。24小时后，将负载FITC和未负载FITC的SLN添加到孔中，并静置孵育4小时。将PBS和来自负载FITC SLN透析的最后一次洗涤物添加到细胞中，以确定可能由可溶性而非包封的FITC产生的细胞荧光量。4小时后，用PBS洗涤细胞两次，用0.05%胰蛋白酶-EDTA（ThermoFisher），再次用PBS洗涤两次，并在FACSCalibur™流式细胞仪（BD）上通过流式细胞术进行分析。每个样本至少记录了10000个事件。分别使用CellQuest（BD）和FlowJo软件（Tree Star，San Carlos，CA，USA）进行数据采集和分析。
2.9统计分析
使用STATISTICA®软件（Statsoft，Tulsa，OK，USA）对从Box-Behnken设计获得的数据进行统计分析。使用GraphPad Prism（GraphPad Software股份有限公司，San Diego，CA，USA）分析与表征、稳定性和细胞毒性相关的数据。统计学差异通过双向方差分析进行评估，然后进行Tukey的多重比较检验。当p值<0.05时，结果被认为具有统计学意义。
3.1昆虫幼虫油基SLN的优化
3.1.1初步筛选
目的评价生产含有SLN的幼虫脂质的可行性，并建立要使用的表面活性剂的最佳浓度，用60mg和初步筛选中含有80 mg Tween®80。表征研究表明，在第一次尝试中无负载和DEX负载的SLN具有非常有希望的物理化学性质（表2.当比较等效表面活性剂浓度时，两种类型的SLN具有相似的特征。较高量的表面活性剂导致较低的PS和较高的ZP。当使用80mg表面活性剂时，制剂的EE和LC得到改善。这些结果是关于所选自变量的起源和各自的
通过设计方法测试质量。
3.1.2 Box-Behnken设计
基于初步结果，选择表面活性剂、提取物和DEX量三个主要自变量（因素）进行BBD，以优化含有SLN的幼虫脂质提取物。对每个自变量进行了三个水平的测试，结果产生了15种纳米颗粒的组合并进行了表征。获得的结果如表3所示。根据定义的理想标准对配方进行了优化——应将PS、PDI和ZP值降至最低，以确保皮肤渗透和胶体稳定性的足够性能，并应将EE和LC值最大化，以实现尽可能好的DEX包封。为了验证优化程序，使用最佳水平的因素制备了SLN制剂。优化配方的组成以及所收集的预测和实验响应如表4所示。实验值与理论值相似，通过设计策略验证了质量。
3.2昆虫幼虫油基SLN的储存稳定性
为了评估稳定性并确认所有性能在储存过程中都得到了保持，在室温（25±3°C）下对空载和DEX负载的优化配方进行了60天的表征。总体而言，SLN表现出良好的稳定性，并对PS、PDI、ZP、pH、EE和LC保持了令人满意的物理化学特性（图1）。从第14天起，对于未负载的制剂，仅观察到pH的离散变化，但对于皮肤应用（pH 4至6）在足够的值内。在稳定性评估期间，EE的值保持在80%左右，LC的值保持为1.2%左右。
图1。在室温下储存60天后，对空载和DEX负载的SLN的物理化学特性进行评估。（a） 粒度和多分散指数（PDI）；（b） ζ电位（ZP）；（c） pH；（d） 封装效率（EE）和负载容量（LC）。数据显示为平均值±标准差（n=3），与初始数据（t=0天）相比的显著差异用*表示（p值<0.05）
3.3昆虫幼虫油基SLN的体外药物释放
为了评估优化制剂的递送性能，进行了体外药物释放研究。研究了26小时内DEX释放到受体相中的累积百分比（图2）。15小时后，固体脂质基质中包埋的DEX已完全释放。
3.4昆虫幼虫油基SLN的细胞毒性和细胞摄取
在孵育24小时后，使用MTT法评估DEX、脂质提取物、空载SLN和负载DEX的SLN对HaCaT细胞活力的影响。测试化合物或配方的结果如图3所示。与载体对照细胞相比，用毒性浓度的DMSO（5%）处理的细胞的活力显著降低，正如预期的那样。在所测试的条件下，暴露于DEX或脂质提取物不会引起显著的细胞毒性。对于未负载的SLN，将人角质形成细胞的活力维持在对应于50µM DEX的浓度，而对于负载的SLN，将其保持在对应于10µM DEX的浓度。对于更高浓度的昆虫幼虫油基SLN，在这些条件下观察到活力降低。
通过在与负载FITC的SLN孵育后测量单个细胞的荧光来评估纳米颗粒将其内容物递送到细胞中的能力。与许多纳米颗粒孵育的细胞的平均荧光与用未负载的纳米颗粒孵育的细胞的荧光相比，对应于1250和2500 mg/L的脂质提取物的荧光分别高出13和30倍（图3（d））。用PBS或纳米粒子透析后剩余的可溶性FITC孵育的细胞呈现较低水平的荧光，从而证明可溶性FITC的可能痕迹确实导致细胞荧光。
本工作旨在探索BSF幼虫生物量中的脂质提取物作为固体脂质纳米颗粒的核心材料的潜力，该固体脂质纳米具有双重功能——有效递送糖皮质激素和促进屏障功能。开发策略基于实验设计（BBD），以获得能够封装模型药物（DEX）的优化配方，然后根据理化特性、随时间的储存稳定性、药物释放和细胞毒性和摄取。我们的数据支持BBD是纳米载流子优化的强大工具，如前所述（12，13）。优化的DEX负载的SLN具有令人满意的物理化学特性，即PS<200nm，粒度分布均匀（PDI<0.3），有希望的胶体稳定性（ZP低于-30 mV），以及提高的EE和LC值（分别高于85%和1.2%）。根据文献（14，15），这些特性适合局部应用，有望用于治疗特应性皮炎。
值得注意的是，用昆虫幼虫油配制的SLN在皮肤递送方面表现出的物理化学性质与使用传统商业固体脂质制备的SLN相当，如Precisrol ATO5®（PA5）、Compritol®888 ATO和Dynasan®114/118（16，17）。与这些商业脂质相关的一个缺点是在生产方法中需要提高熔融温度，例如PA5和Compitol®（约80°C）。BSF油可在50°C，除了从昆虫幼虫生物质中提取外，还可以降低能源和生产成本，并扩大热敏化合物的SLN多功能性。
由于颗粒聚集，SLN在尺寸方面的长期不稳定性和由于药物从脂质基质中排出，EE/LC通常会损害SLN（14，18）。然而，在这项工作中，观察到纳米颗粒在室温下60天具有良好的物理稳定性。一般来说，所有特性都得到了保持，并且在储存14天后仅观察到pH值的离散变化。然而，这些值保持在皮肤应用的可接受范围内（19）。这一数据再次表明，昆虫幼虫油作为一种创新成分用于SLN外用的潜力配方。
为了评估优化制剂治疗AD的潜力，研究了DEX从脂质颗粒中的释放26小时。大约60%的药物在最初的4小时内释放，8小时后达到平稳期，15小时时几乎完全释放（97%）。在一项使用阳离子聚合物纳米胶囊的研究中，Beber等人（20）观察到5小时后DEX释放约45%。尽管如此当DEX被封装在脂聚体系统中时观察到结果，其中在20小时时，只有60%的药物从纳米系统中释放（21）。尽管聚合物的掺入可能有助于延迟DEX的释放，但昆虫幼虫油基固体脂质纳米颗粒（SLN）表现出足够可控的药物释放特性，适用于日常应用方案。
为了分析DEX、BSF脂质提取物和DEX负载和卸载SLN的细胞毒性，用HaCaT细胞进行了MTT分析。该药物、脂质提取物以及空载和载药的SLN（高达10µM的药物）被发现具有细胞相容性。有趣的是，用最高浓度的脂质提取物处理的孔似乎表现出细胞增殖的增加，这表明这是一个有前景的用于未来皮肤配方的生物材料，即使在高浓度下也是如此。细胞摄取测定的结果产生高达2500mg/L的脂质提取物浓度的SLN的高度内化。这些数据证实了这些纳米载体用于皮肤应用的体外安全性及其在角质形成细胞中达到糖皮质激素细胞内靶点的可用性。
总之，这项概念验证研究强化了昆虫幼虫油是一种很有前途的生物材料，可以在特应性皮炎的治疗中配制用于DEX递送的SLN。正在进行的研究正在深入研究由昆虫幼虫油制成的无负载纳米载体的体内安全性，以及它们在形成封闭膜和恢复皮肤屏障特性方面的有效性。
