在 2021 年欧洲批准可食用物种 Tenebrio molitor、Locusta migratoria、Acheta domesticus 和 Alphitobius diaperinus 供人类食用后（欧盟委员会，2021a;欧盟委员会，2021b;欧盟委员会，2022 年;欧盟委员会，2023 年），其他昆虫物种也受到期待，如 Hermetia illucens、Gryllodes sigillatus 或 Apis mellifera（Mancini 等人，2022 年）。此外，自 2017 年以来，这些昆虫物种中的大多数已被授权用于水产养殖的饲料生产，自 2021 年以来已被授权用于家禽和猪的饲料生产（van Huis、Rumpold、van der Fels-Klerx 和 Tomberlin，2021 年）。在这些物种中，H. illucens（黑水虻幼虫，BSFL）的幼虫近年来非常受欢迎，因为它具有作为食品和饲料蛋白质替代来源的巨大潜力，以及将农业食品残留物生物转化为高价值产品的强大能力（Dörper、Veldkamp 和 Dicke，2021 年;Kaczor、Bulak、Proc-Pietrycha、Kirichenko-Babko 和 Bieganowski，2022 年;Mohan 等人，2022 年）。

在BSFL的价值产品中，除了蛋白质，脂肪也很突出。这是因为 BSFL 的脂质分数可以达到 15-58% 的值，主要取决于底物（Bellezza Oddon、Biasato、Resconi 和 Gasco，2022 年;Ewald 等人，2020 年;Suryati、Julaeha、Farabi、Ambarsari 和 Hidayat，2023 年;Wang&Shelomi，2017）。此外，这种脂肪具有有吸引力的非典型脂肪酸谱，因为中链月桂酸是 BSFL 脂肪的主要脂肪酸，其值接近 50%。棕榈酸、肉豆蔻酸以及油酸和亚油酸也是 BSFL 脂肪酸谱的一部分（Cantero-Bahillo 等人，2022 年;Fornari 等人，2023 年;Franco 等人，2021 年）。这使得 BSFL 脂肪与椰子油或棕榈仁油非常相似（Nitbani、Tjitda、Nitti、Jumina 和 Detha，2022 年）。目前，这些植物油是生产富含月桂酸的油的主要来源。对这些油的主要兴趣是因为月桂酸是一种众所周知的脂肪酸，具有用于食品、饲料、化妆品和制药用途的有趣特性（Borrelli 等人，2021 年;Nitbani 等人，2022 年）。具体来说，月桂酸及其部分甘油酯的强抗菌活性是最受欢迎的生物活性之一，显示出对多种病原体（包括多重耐药细菌）的广泛抗菌谱，这与它们破坏细菌细胞膜稳定的能力有关（Borrelli等人，2021;Nitbani 等人，2022 年）。然而，关于 BSFL 脂肪作为可持续性较差的植物油替代品的抗菌潜力的具体研究仍然很少（Dabbou 等人，2020 年;Lee， Yun， & Goo， 2022;Marusich、Mohamed、Afanasev 和 Leonov，2020 年）。

关于BSFL脂肪，需要注意的是，用于BSFL主要加工步骤（屠宰、干燥和最终脱脂）的方法类型可能会影响衍生脂肪的脂质组成。这是因为自屠宰的初始过程以来，在昆虫中发现了脂肪酶的强烈活性，在 BSFL 中尤为重要，这可能导致脂质的强烈脂肪分解以及随后游离脂肪酸 （FFA） 和部分甘油酯的增加（Caligiani 等人，2019 年;Leong， Yap， & Kutty， 2022;Ravi 等人，2020 年）。从食用油的质量角度来看，这是一种负面影响，因为高水平的FFA通常与脂肪的质量差和降解有关，因此食用油的最大酸值通常受到限制。因此，与冷冻方法相比，用于屠宰脂解酶的热方法，作为用于许多可食用昆虫的典型焯水方法，已被证明可以使BSFL脂肪具有适当的质量和完整性，而冷冻方法已被证明可以保持脂肪酶的活性，并且也经常用于可食用昆虫（Leni， Caligiani和Sforza，2019年;Leong 等人，2022 年;Ravi 等人，2020 年）。然而，从BSFL脂肪的抗菌角度来看，我们提出那些可能有利于脂肪分解为FFAs的加工条件，主要是月桂酸，将是令人感兴趣的。然而，关于哪些因素在屠宰过程中调节脂肪分解活性的大小，并且不影响脂肪和膳食的其他质量参数的明确结论仍不清楚。此外，关于屠宰后的后续步骤，如干燥和脱脂通常，关于这些过程对BSFL脂肪的脂肪分解产生游离月桂酸的影响的信息很少。考虑到非热方法也被用于 BSFL 加工过程中的此类阶段，例如用于干燥或压榨的冷冻干燥和用于脱脂的超临界流体（Hernández-Álvarez、Mondor、Piña-Domínguez、Sánchez-Velázquez 和 Melgar Lalanne，2021 年;Ojha、Bußler、Psarianos、Rossi 和 Schlüter，2021 年;van Huis，2019 年）。然而，热干燥方法，如烘箱干燥，也是 BSFL 最常用的方法之一（Hernández-Álvarez 等人，2021 年;Ojha 等人，2021 年;van Huis，2019 年）。因此，应该同时考虑这三个工艺过程（屠宰、干燥和脱脂），并研究它们之间的相互关系作为最终过程的连续操作，以提出最佳的工艺组合，以最有效地生产游离月桂酸含量高的脂质副产品，因此， 预期的抗菌活性;或者，相反，生产具有最佳脂质质量和最低酸度的脂质副产品。

因此，本研究的主要目的是评估BSFL不同屠宰、干燥和脱脂条件对所得脂肪的FFAs含量和抗菌活性的影响和相互关系。为了进行这项研究，用于食用昆虫加工的典型方法和条件（Hernández-Álvarez等人，2021 年;Ojha 等人，2021 年;van Huis，2019），主要是那些非热法和热法，进行了比较。因此，将焯水和冷冻作为屠宰方法进行比较，分别以烘箱或冷冻干燥作为干燥方法，并通过机械压榨或超临界CO进行比较2作为脱脂方法。

2.1. 幼虫的屠宰

BSF幼虫由Entomo Agroindustrial（西班牙穆尔西亚Cehegin）使用基于蛋鸡饲料的典型基质饲养。通过焯水或冷冻屠宰幼虫，每个程序一式两份（每次重复8公斤）。在屠宰之前，将幼虫过筛并洗涤，将它们浸入冷水中的篮子中，然后沥干。为了焯水，将幼虫以样品与水的1：10（w / v）比例浸入90°C的水中40秒。之后，将幼虫浸入冷水中并排干。为了冷冻，将幼虫在-20°C下冷冻24小时。每次屠宰后，将每批猪分成两半，通过烘箱或冷冻干燥进行干燥。

2.2. 幼虫的干燥

在65°C下在传导烘箱中在最大幼虫层厚度≤1cm）的托盘中进行无内部通风的烘箱干燥24小时。使用3托盘冷冻干燥机（LyoBeta 15，Telstar，Terrassa，Spain）进行冷冻干燥4天，程序为-20°C2小时，然后从-20°C逐渐增加到20°C，然后在剩余时间内保持在20°C，冷凝器为-81°C。在每次干燥程序之后，将每批样品分成两半，通过机械压榨或超临界流体萃取（SFE）进行脱脂。干燥的样品在室温下储存并尽快脱脂（在干燥后储存的 1-3 天内）。

2.3. 样品脱脂

对于机械脱脂，使用带有加热夹套的螺旋压榨机（InVIA，巴塞罗那，西班牙）提取450克干燥的幼虫，以使油排出。将室温下的幼虫加入压榨机中，无需事先预热。压机在最低温度（136.0±13.1°C）下预热，在压榨过程中连续监测压机头的温度，平均最大值为140.4±10°C，平均最小值为126.6±11.9°C，具体取决于批次。将收集的粗脂肪以 3400 ×g 离心（Multifuge 3SR+ 离心机，Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）10 分钟以除去共提取的固体。

超临界一氧化碳2脱脂是使用超临界CO进行的2提取设备（型号 Thar SF2000，Thar Technology，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）并遵循 Cantero-Bahillo 等人（2022 年）先前执行的优化条件，并由 Fornari 等人（2023 年）放大。在提取之前，将500克干燥的幼虫在刀磨机（Grindomix GM 200，Retsch GmbH，Haan，Germany）中研磨。提取单元（1350 厘米3）装有450 g样品。脱脂在450 bar、60 °C和CO下进行2流量为 130 g/min，持续 240 分钟。

2.4. 游离脂肪酸的表征

根据 Herrera、Navarro del Hierro、Fornari、Reglero 和 Martin （2019） 的说法，通过 GC-MS-FID 分析了 FFA，先前通过 N，O -双（三甲基硅基）三氟乙酰胺 （BSTFA） 衍生化。这允许单独定量所获得的脂肪样品中存在的FFA。简而言之，将脂肪与BSTFA以20mg / mL混合，并在75°C下加热1小时，每15分钟振荡一次。之后，将样品在室温下冷却 5 分钟，并加入己烷以达到 10 mg/mL 的终浓度。随后，通过配备自动进样器（G4513A）、分流/不分流进样器、火焰离子化检测器和三轴质谱仪检测器（5975C）的GC-MS（Agilent 7890 A，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）分析样品。使用HP-5MS色谱柱（30 m长x 0.25 mm内径x 0.25μm膜厚）分离脂质化合物。氦气用作载气，流量为 2 mL/min。进样器温度为260°C，质谱仪离子源和界面温度分别为230°C和280°C。样品进样（1μL）以不分流模式进行。分析开始将烘箱保持在50°C下3分钟，然后以15°C / min增加至310°C，然后保持25分钟。质谱图是通过70 eV的电子冲击获得的。扫描速率为 1.6 次/秒，质量范围为 30–700 amu。脂质化合物的鉴定由NIST MS数据库进行。为了定量FFA，从月桂酸（C12：0）、肉豆蔻酸（C14：0）、棕榈酸（C16：0）、亚油酸（C18：2）和油酸（C18：1）的标准品（Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，Germany）获得校准曲线，这些标准品之前也按照样品描述的相同程序进行衍生化。

2.5. 细菌菌株、生长培养基和培养条件

在六种具有代表性的食源性病原菌中评估了BSFL脂肪的抗菌活性，革兰氏阴性菌：大肠杆菌（E.coli）25922美国典型培养物保藏（ATCC），肠沙门氏菌（S. enterica）14028 ATCC，铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）9027 ATCC;革兰氏阳性：金黄色葡萄球菌 （S. aureus） 25923 ATCC、单核细胞增生李斯特菌 （L. monocytogenes） 13932 ATCC 和枯草芽孢杆菌 （B. subtilis） 11774 ATCC。将所有细菌菌株储存在-80°C的布鲁氏菌肉汤（BB）（Becton，Dickinson，&Co，Madrid，Spain）中，加20%甘油（w/w）。琼脂平板培养基由补充有5%除颤绵羊血（MHB）（Becton，Dickinson，&Co）的Müeller-Hinton琼脂组成，液体生长培养基由BB组成。细菌培养物的制备方法如下：将冷冻储存的菌株通过接种在MHB中重新活化，并在37°C的有氧条件下在轨道振荡器（Infors HT，Biogen Científica，Madrid，Spain）上孵育24小时。之后，将分离的菌落接种到10mL的BB中，并在搅拌（150rpm）后在上述条件下孵育24小时，直到指数期晚期，并用作实验接种物。这些细菌接种物培养物 ∼1 × 108菌落形成单位（CFU/mL）用于抗菌实验测定。

2.6. 抗菌活性

按照Silvan等人（2020）描述的程序评估BSFL脂肪的抗菌活性。将BSFL脂肪溶解在10%（v/v）吐温-80（2.5：1;v/v样品与溶剂）中。简而言之，将 1 mL BSFL 脂肪溶液转移到含有 4 mL BB（14% 终浓度脂肪，v/v）的不同烧瓶中。然后，细菌接种物（100 μL ∼1 × 108CFU/mL）在无菌条件下接种到烧瓶中。将培养物在37°C的有氧条件下搅拌（150rpm）孵育24小时。通过将 1 mL 无菌水转移到 4 mL BB 和 100 μL 细菌接种物中来制备细菌生长对照。孵育后，在盐水溶液（0.9%NaCl）中制备混合物的连续十进制稀释液，并将（20μL）接种到新鲜的MHB琼脂上。将板在上述条件下孵育，并在24小时后评估CFU的数量。所有实验均一式三份（n = 3）进行，结果以CFU/mL表示。

2.7. 最小抑菌浓度

按照上述程序确定通过冷冻、冷冻干燥和 SFE（对革兰氏阳性菌最活跃的脂肪）处理的样品的最小抑菌浓度 （MIC）。将脂肪溶液在BB中稀释，以获得所需的最终浓度。MIC被定义为与治疗24小时后的对照生长相比，引起活力显着（p < 0.05）下降的最低脂肪量，以菌落形成单位（CFU）/ mL表示（Silván等人，2013）。测定MIC的稀释间隔范围为12%至0.09%（v/v）。

2.8. 使用月桂酸和月桂酸的纯标准品验证抗菌活性

按照上述程序研究了月桂酸纯标准品对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和枯草芽孢杆菌）的抗菌性能。此外，月桂酸甘油酯（Sigma-Aldrich）也作为对照进行了测试，以便与酯化为甘油三酯的月桂酸的典型脂质形式进行比较。所有分析均使用与最活跃的脂肪样品中可稀释的最高浓度（首先用乙酸乙酯稀释的样品）中的最高浓度进行，然后在BB中达到3 mg/mL（月桂酸）和1.8 mg/mL（三月桂酸）的最终浓度。最活跃的脂肪的原始浓度为月桂酸的 19.9 mg/mL，三月桂酸的 37.1 mg/mL。

2.9. 统计分析

使用 SPSS 26.0 统计包（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）的一般线性模型程序，通过方差的三因素分析来评估所考虑因素（屠宰、干燥和脱脂程序）的影响及其各自的相互作用。当任何因素的影响显著（p ≤ 0.05）时，使用事后Tukey检验分析组间差异。采用t检验（p ≤ 0.05）（SPSS 26.0）对各提取物对照组的抗菌活性进行统计学分析。进行 Pearson 相关性检验以进行其他分析。

3.1. BSFL加工对脂肪游离脂肪酸含量的影响

BSFL的不同屠宰和干燥方式相结合，产生了不同脂肪含量的干燥幼虫。因此，在脱脂之前，脂肪含量在 18-29% 的范围内，具体取决于屠宰和干燥的组合方法（Hurtado-Ribeira 等人，2023 年）。一般来说，无论处理方式如何，这些脂肪都显示出相似的整体脂肪酸特征，平均月桂酸含量为50.3±2.1%，其次是棕榈酸（13.2±0.9%）、肉豆蔻酸（10.3±0.3%）、油酸（8.6±0.6%）和亚油酸（7.2±0.6%），以及少量的其他脂肪酸，如亚麻酸、硬脂酸或棕榈油酸。

在对幼虫进行处理后，为了评估其对脂肪分解的影响，分析了来自不同屠宰、干燥和脱脂模式的BSFL脂肪样品的FFAs含量和FFA谱。从图1中可以看出，BSFL的不同屠宰和干燥模式产生了具有不同总FFA含量的脂肪。因此，一般而言，冷冻屠宰和冷冻干燥作为独立因素导致FFA的产量最高。正如预期的那样，这种 FFA 谱主要由月桂酸组成（约占总 FFA 的 50%），因为一般来说，这是整个 BSFL 脂肪的主要脂肪酸。其余FFA的含量很小（在1.7-3.8%的范围内，取决于脂肪酸和处理）。然而，棕榈酸和肉豆蔻酸的释放遵循与月桂酸相似的模式（根据图1，屠宰和干燥的p<0.05）。在油酸和亚油酸的情况下，无论屠宰方法如何（p > 0.05），只有冷冻干燥才引起显着增加（p < 0.05）。此外，还观察到屠宰和干燥两个因素对总FFAs含量有显著的交互作用。因此，冷冻屠宰结合冷冻干燥导致总FFAs含量最显著（FFAs的平均值为21%），其中月桂酸主要由月桂酸组成。相反，无论屠宰方法如何，经过烘烤干燥的幼虫都是FFAs含量最低的幼虫（平均值为1%FFAs）。因此，所获得的结果将证实，那些具有高FFAs含量的样品发生了脂肪分解现象，这些样品来自非热屠宰和干燥方法（冷冻和冷冻干燥）。根据Leni等人（2019）的说法，在通过冷冻杀死BSFL的过程中，激活了强烈的能量代谢，其中包括内源性脂肪酶对甘油酯的脂肪分解。相反，通过焯水，酶的快速死亡和失活不允许这种代谢反应，并且Leni等人（2019）检测到较低的相关代谢物。与冷冻后冷冻干燥相比，由于热焯水方法导致的酶失活的这种效应可以解释当前研究中观察到的 FFA 水平较低，先焯水后冷冻干燥（图 1）。因此，焯水的短暂热处理可以使脂解酶部分失活，与冷冻屠宰相比，脂肪分解略少。

3.2. BSFL加工对脂肪抗菌活性的影响

尽管从质量的角度来看，FFAs含量是理想的，但与游离月桂酸相比，那些产生最高脂肪分解的BSFL技术工艺将是首选，以防希望从BSFL获得潜在的抗菌油。生产该产品的潜力将是一种从BSFL中重新评估脂肪的方法，BSFL目前在蛋白质粉生产过程中作为副产品获得，但与蛋白质粉的主要兴趣相比，目前没有明确的商业用途。当尚未推荐或建立明确的标准化或首选的BSFL处理方法时，这一点尤其有趣，因此现在本研究中使用的热或非热方法正在被模糊地使用和组合。因此，为了证实BSFL的特定加工方法可能导致抗菌脂肪的假设，我们研究了BSFL的加工对不同获得的脂肪样品对几种食源性病原体的抗菌活性的影响。如表1所示，BSFL脂肪对革兰氏阳性菌的抗菌活性明显高于革兰氏阴性菌。事实上，只有冷冻、冷冻干燥和SFE脱脂后获得的脂肪，总FFA含量最高（图1），对革兰氏阴性铜绿假单胞菌菌株表现出显著的抗菌活性（p < 0.05），使细菌生长减少1.42 log CFU/mL。相比之下，多达四种不同的脂肪对革兰氏阳性菌表现出抗菌活性，并引起更大程度的生长抑制。同样，通过冷冻、冷冻干燥和SFE脱脂屠宰后获得的脂肪是最有效的，对单核细胞增生李斯特菌和枯草芽孢杆菌具有杀菌作用（<1.48 log CFU/mL），并使金黄色葡萄球菌的生长减少6.7 log CFU/mL。

本研究主要关注月桂酸的游离形式，以同时展示BSFL技术加工对FFAs释放对脂肪品质的负面影响，以及以月桂酸为主的FFAs对抗菌活性的积极影响。因此，为了深入研究月桂酸对抗菌活性的直接影响，我们直接评估了其对革兰氏阳性菌的有效性（表3）。此外，出于比较原因，我们评估了三月桂酸在观察到的行为中的作用，这是在没有脂解条件下在 BSFL 脂肪中发现月桂酸的最常见形式。此外，还测试了两种月桂酸形式，其比例与在最活跃的脂肪样品中发现的比例接近，以测试月桂酸的两种主要脂质形式的潜在相互作用效应。结果证实，月桂酸本身和与三月桂酸混合在所有病例中均具有杀菌作用，而月桂酸本身对单核细胞增生李斯特菌和枯草芽孢杆菌的生长没有显著影响。同样，Kabara，Swieczkowski，Conley和Truant（1972）也证明了月桂酸对多达10种易感微生物的抗菌作用，而月桂酸在测试浓度下没有显示出抑制活性。因此，由于甘油三酯是BSFL活性最低的样品（那些显示少量FFA含量的样品）的主要脂质形式，这与这些BSFL脂肪样品缺乏抗菌活性的情况一致，这些样品主要来自烤箱干燥（图1）。然而，应该指出的是，月桂酸甘油酯被证明对金黄色葡萄球菌具有杀菌作用（表3）。这种行为与以下事实一致：许多金黄色葡萄球菌菌株能够产生并分泌到细胞外培养基中，该脂肪酶属于甘油酯水解酶，并且是该病原体的重要毒力因子（Jaeger等人，1994）。这种脂肪酶将有助于用游离月桂酸和其他具有强抗菌活性的部分甘油酯（如月桂酸单月桂酸）富集培养基（Borrelli 等人，2021 年）。

因此，根据所有这些发现，并考虑到BSFL脂肪样品的抗菌活性的显着结果，从酸值的角度来看，BSFL脂肪样品同时具有最差的质量，因此进一步的研究将具有重要意义，以确定脂质质量的其他参数是否也会受到影响，例如脂质氧化， 理化特性、营养价值或感官属性，因为游离酸度可能会影响这些参数。这将提供这种BSFL脂肪的全部潜力的更完整信息，以防不仅需要这种脂肪的抗菌活性。关于脂质氧化，我们最近证明，对于当前研究中研究的相同样品，大多数抗菌样品（冷冻、冷冻干燥和 SFE）的氧化质量与其他处理相当，其稳定性甚至优于通过漂白屠宰获得的稳定性（Hurtado-Ribeira 等人，2023 年），这证明了这种抗菌脂肪的质量的另一个积极属性。关于BSFL部分水解脂肪的营养作用，有趣的是，在动物饲料中使用油时，FFA含量高不会成为问题，因为这种脂肪可以被认为类似于所谓的“酸性油”或“脂肪酸馏出物”，它们是富含FFA的油，来源于食用植物油的精炼（Varona等人， 2021年a;Varona 等人，2021b）。由于成本较低且营养性能合适，这些油被允许用于动物饲料中，以替代传统油，以增加饲料的膳食能量（Varona 等人，2021a，Varona 等人，2021b）。除了高酸度 BSFL 脂肪的这种潜在用途外，本研究中证明的抗菌活性将为该产品在动物饲料中的使用提供额外的价值，因为目前对开发替代日粮中抗菌剂使用的添加剂感兴趣。事实上，这就是目前声称的在动物喂养中使用中链脂肪酸的策略的情况，中链脂肪酸是月桂酸最流行的形式（Borrelli 等人，2021 年;杰克曼、博伊德和埃尔罗德，2020 年;Rebucci 等人，2021 年;Rolinec 等人，2020 年;Suryati 等人，2023 年）。

从FFA的角度来看，BSFL的屠宰和干燥方法会影响衍生脂肪的质量。因此，通过冷冻和干燥进行屠宰，通过冷冻干燥引起脂肪对FFAs的最高脂肪分解，主要是月桂酸。此外，由于这两个步骤的相互作用，冷冻屠宰与冷冻干燥相结合会产生质量最差的 BSFL 脂肪。相比之下，无论屠宰方法如何，烘箱干燥都是保持脂肪完整性的最佳方法。BSFL脱脂的最后一步不影响脂肪的脂肪分解。因此，从质量的角度来看，BSFL的最佳加工方法是将焯水屠宰与烘箱干燥相结合，而不管脱脂方式如何。相比之下，从抗菌的角度来看，优选那些产生最高脂肪分解的工艺过程，即通过冷冻屠宰，通过冷冻干燥进行干燥，通过SFE进行脱脂。BSFL的这种特定加工模式产生一种脂肪，对革兰氏阳性菌具有相关的抗菌活性。月桂酸似乎是主要参与BSFL脂肪抗菌活性的FFA。

因此，考虑到BSFL的标准化或优选加工方法尚未明确推荐或确定，这些发现为选择BSFL的最佳加工模式提供了指导，以充分利用BSFL获得的脂质副产品可以提供的潜在价值，无论是从食品使用的角度来看， 这需要加工方法以产生高质量（低酸度），或者从生物活性应用的角度来看，使用产生抗菌脂肪（高酸度）的加工方法。这种生物活性脂肪可用于动物饲养、食品、制药或化妆品的不同应用。然而，在生产方法方面，应考虑冷冻、冷冻干燥和SFE相结合的经济成本，特别是冷冻干燥和SFE的成本。因此，只有在脂肪达到有利可图的再价值化或证明主要获得的产品具有额外的优势（如蛋白质粉）的情况下，该过程的成本才是值得的。无论如何，无论采用何种加工方式，对于酸度质量较差的脂肪，所证明的最佳抗菌活性都可以被认为是一种有趣的方法，用于对不符合食品应用所需质量标准的BSFL脂肪进行再估价。